超纯水的内毒素定量测定

     革兰氏阴性菌,如大肠杆菌（E. coli）和假单胞菌(Pseudomonads)等的细胞壁成分被认为是内毒素。它们具有一个亲水性多糖和亲脂性脂质结构，有别于它们所源自的细菌,具 有高度的热稳定性和pH稳定性。内毒素属于致热源，如果它们与粘膜发生接触或者一旦它们进入血液循环，便会导致发热（参考文献详见Steck, 20061）。

     根据通用的药典，在药物的生产工艺中内毒素含量不可超出所规定的限值。

    在生物制药（如：免疫球蛋白）生产所需的哺乳动物细胞培养中，内毒素的出现可能会导致死亡。因此，在生物制药生产、细胞系传代，或者细胞培养过程中需要使用超纯培养基，当然也相应的需要超纯水，它们所含有的内毒素含量水平已获证明低于所规定的限值。

    本研究的目的在于展示Arium pro VF系统产生的超纯水所具有的内毒素含量远远低于规定的限值，因而可用于上述各种应用。

实验方法

    为了对Arium pro VF系统所生产的超纯水中的内毒素含量进行检测，我们分别采用了凝胶法和显色法来测试。
 

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实验结果

    在 0.001 EU/ml-0.05 EU/ml的浓度范围内，凝胶法显示的是阴性结果，意即无凝胶形成（无内毒素检测到；见表1）；当浓度≥0.1 EU/ml时发生了凝集反应。该结果显示了在凝胶法的检测敏感限值内，在Arium pro VF系统所生产的超纯水中未出现内毒素。

     显色法中，在405nm波长处的60吸附读数（见下图）根据标准样品中内毒素含量的不同生成了不同斜率的曲线。达到吸收率所需要的时间通过特殊的计算机程 序进行计算，并将之用为推断具有未知内毒素含量的样品的依据（具体的值详见表1-显色测试）。由于具有*低浓度（0.005-0.001 EU/ml）的标准样品和Arium水未达到所需的计算内毒素含量的消光值，因此它们被认定为低于检测限值。

     Arium pro VF超纯水所获得的值明显比0.001 EU/ml曲线的绘制点更加低。下图显示了与两个选定的内毒素标准（0.05 EU/ml and 0.005 EU/ml）相比，在自来水、去离子水（DI水）和Arium水中所测得的内毒素浓度的数据集合。在水样品中的内毒素含量通过使用内毒素标准所测得的值来 计算，详见表2.。

     在DI水样品中，检测到内毒素为0.02 EU/ml，这个值低于WFI（注射用水）现行的有效值。在自来水中，出乎意料地检测到高达25 EU/ml的内毒素载量。该结果未作进一步分析。与之相对，在系统所产生的超纯水中所检测到意料之外的低值，< 0.001 EU/ml，这个值远远低于常见的限值。

     在DI水样品中，检测到内毒素为0.02 EU/ml，这个值低于WFI（注射用水）现行的有效值。在自来水中，出乎意料地检测到高达25 EU/ml的内毒素载量。该结果未作进一步分析。与之相对，在系统所产生的超纯水中所检测到意料之外的低值，< 0.001 EU/ml，这个值远远低于常见的限值。

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 结论

     测试结果显示了Arium pro VF系统生产的超纯水可作为一种方便、实惠的选择，用于内毒素测试的样品制备，因为在其所生产的超纯水中检测到的内毒素浓度非常低（<0.001 EU/ml）。得到的结果也证实了早期关于在Arium超纯水中发现内毒素载量<0.001 EU/ml的试验。

     在此超纯水中的内毒素浓度远远低于美国药典所规定的限值，这也使得该超纯水理论上适用于制药产品的生产/内毒素监测方面。相关的例子包括产品制剂，透析过滤解决方案，层析缓冲液以及用于萃取、清洗、无菌步骤和细胞培养方案的水等。

     在细胞培养应用范围内，我们需要在工艺的各个步骤都对污染物保持高度警惕。为了对内毒素对细胞培养物及细胞敏感度的影响保持可控，尤其是与此类内毒素相关时，用于细胞培养的培养基都必须要明确不含可检测到的内毒素含量（见参考文献5）。

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参考文献/更多信息

1 Steck, S. : Endotoxine und ihre Bedeutung bei R & D Applikationen. Bioforum 6/2006.
2 Endosafe® -PTS™ Glucan Assay, Charles River Laboratories International, Inc, 2009.
3 Endotoxin Compendium, V 2.11, Hyglos GmbH, Bernried, Germany.
4 Untersuchungsbericht Fresenius Medical Care, Deutschland GmbH, Werk St. Wendel, 2007.
5 Dawson, M.E. : LAL Update von Associates of Cape CodIncorporated, March 1998, Vol. 16, No. 1. Adapted from the original German article by Dr. Herbig, June 7, 2012

致谢

我们要特别鸣谢德国Laupheim的Stephanie Steck of Rentschler Biotech¬nologie的Stephanie Steck博士，感谢他百忙之中抽空审查此篇文章并就相关主题开展了建设性的讨论。


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